【文献分享】NC 基于抽象模型的等温核酸诊断分析的可编程设计

2022年6月13日 364点热度 0人点赞 0条评论
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研究背景

大家好,今天分享一篇2022年发表在NATURE COMMUNICATIONS上的文章,本研究专注于创建一种通用的等温核酸扩增方法,描述了用于分析算法的抽象模型,可以应用于短核酸序列miRNAs和病原体靶标(如高突变病毒)的多路检测。

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随着检测非传染性或传染性疾病的复杂生物标志物的挑战日益严峻,核酸扩增已成为功能分子分析的基石。基于等温核酸扩增分析不依赖于PCR仪一类复杂的仪器,促使上述诊断朝着即时即地方向发展。

常见的例子包括基于发夹结构的扩增系统,例如交叉引物扩增(CPA)和环介导DNA扩增(LAMP)。在这些机制中,二级发夹作为一种自折叠结构,可以打开互补的目标双链(ds) DNA,暴露其引物位点,引发下一步的引物杂交和延伸。然而,这些方法增加了设计的复杂性,忽略了作为中间产物的反应单元;为了满足对分子的多样性检测,只能开发多种不同的检测方法。

因此,作者用一套基本的指导原则,将引物设计、扩增过程与功能性扩增中间体联系起来,设计了一种通用的、简化的酶介导等温扩增方法,提出了通过创建关键中间基序(功能发夹结构)来催化扩增反应的策略。

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研究内容

作者开发了基于DNA节点和电路的扩增方法,整个过程被简化为五个部分。如图1A所示:功能性发卡自折叠组装过程(实心箭头);引物扩展过程(虚线箭头);通过放大产生的功能性发夹(蓝色方框);功能发卡自折叠产物(绿色三角形为正义链和绿色正方形为反义链)。整个过程围绕两个核心等温扩增反应进行,使用一个包含发夹基序(绿色三角形)的ssDNA,其在环区有一个引物结合位点,与环区互补的引物(图1A中电路S中的2a和电路A中的1s)与环区杂交时,启动延伸反应,用DNA链置换聚合酶打开发夹结构,茎上暴露的结构域(3s)作为起始位点,再次与引物结合进行延伸,产生双链产物,最后发生功能发夹自发的折叠拆卸反应(图1A的实箭头),又形成两个发卡,形成电路闭环,继续进行放大反应。图1A反应产生了长度有限的扩增子,图1D中较小的条带证实了这一点,并在图1C中通过测序证实。作者还证明了不同长度的环片段对反应动力学有着明显影响,其中环长度为40nt时,反应动力学较快(图1B)。

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图1A 功能发夹基序介导的等温放大反应的机制和反应示意图
图1B 不同长度环片段对反应动力学的影响
图1C 扩增产物(3a + 1s + 2s + 3s)的测序结果
图1D 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。laneL:50 bp marker;lane1:限制性内切酶XbaI 酶切扩增产物;lane2:扩增产物(带引发剂);lane3:扩增产物(无引发剂)。
作者展示了一种自动化引物设计系统(图2),该系统只需输入目标序列(如诊断过程中的候选病原体),就可获得引物序列,以便通过扩增进行检测。将此系统在Golang中使用,便可部署在主要操作系统(Windows、Linux、Mac)上,实现基于多线程的高吞吐量分析,运行效率高、容错能力强。

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图2 引物设计软件流程图包括(1)筛选目标序列(2)随机设计筛选US序列(3)根据四种不同方案过滤输出最终引物。

作者通过实验执行两种不同的核酸等温扩增策略来展示基本模型的效用,每种策略都阐明了功能基序内相互作用来催化扩增反应的不同机制。

策略1:尾巴策略

如图3A所示,通过正向引物和反向引物合成一个通用尾巴(称为us),其5’端具有相同的序列,3’端与特定的目标序列互补,产生一个功能性发夹基序(us+1s+2s+ua),然后通过DNA聚合酶进行引物延伸;另外还添加了两个外部引物(F3,B3),与在传统LAMP系统中使用的策略类似,增加了反应的动力学,达到指数放大的效果,图3B是分子反应过程的二级结构示意图。此方法可用于扩增病原体的序列,图3C证明其特殊结构的形成;图3D证实在无靶标的情况下不产生扩增子,有靶标的情况下才开始扩增。此方法也可以直接应用于短小序列的检测,并通过浓度依赖的方式(低至fM浓度)检测miR21 microRNA(图3E)。作者还检测了更广泛的miR-7家族,证明该方法能够从同一家族的其他成员中检测低浓度的miR-7-a(图3G)。

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图3 引物含有通用5端的等温扩增反应图。
A 扩增示意图。靶标加入后形成us+1s+2s+ua的功能性发夹结构并开始扩增。
B 二级结构机理。具有一般尾的引物分别为1s+Us和2a+Us。
C 功能发夹结构测序(us+1s+2s+ua)。TTCGAA和TTCGAA作为标记插入引物。
D 模板浓度对扩增的影响。lane L:marker;lane 1:40 M结核细胞;lane 2:4 M结核细胞;lane 3:0.4 M结核细胞;lane4:缓冲液。
E 实时放大曲线,表明为浓度依赖性检测。插图为不同浓度的mir-21的平均阈值时间(Tt)
F 凝胶电泳。lane1:20pM;lane2:空白。
G miR-7检测的特异性。miR-7b(红色);miR-7c(灰色);miR-7d(蓝色)。左y轴为miR-7a归一化放大信号,右y轴为其他miR的放大信号。
作者进一步构建了多路复用策略,以检测单个长核酸序列中的不同片段(图4A)。即用两个不同序列启动相同的分析输出。以HIV检测为例,设计两组交叉引物,其包含三种不同的构造:(1) 起始序列(P1中的1s)与目标的保守区域1互补;(2)下游的一个序列(P1的2a),与同一目标相反链上的一个引物位点互补(2s, P2的引物位点);(3)合并序列(P1中的3s),与另一个交叉引物(P3中的3s)的引物位点相同,使该引物可以扩增目标物的另一个保守区域2。在扩增循环过程中,交叉引物延伸反应产生的产物形成中间功能基序,区域1的中间功能基序有与区域2相同的引物结合位点,使能够结合区域2的引物并被DNA聚合酶延伸,反之亦然。并用凝胶电泳对反应进行了验证(图4B)。

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图4 交叉引物策略的HIV两个基因区域的多路扩增。
A 扩增示意图。引物P1-4可交叉扩增2条通路
B 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。lane L:25 bp marker;lane1:靶标1;lane2:靶标2;lane3:1号和2号靶标同时存在;lane4:无靶标。

策略2:递进模型

当将额外的反应途径连接到主要途径时一般会出现复杂性的增加,例如EXPAR中扩增途径的一个产物作为第二个反应的输入。作者提出的第二种策略就是用来克服这种复杂性增加。利用中间体作为不同反应途径之间的链接,设计了一个等温扩增体系,该体系含有一个与目标序列3端互补的正向引物(3a+1s),与目标单个序列互补的反向引物(2a、3a、4a和5a),生成三个不同的功能发夹,这些发卡都包含相同的基序(3a+1s+2s+3s)。引物延伸过程中,引物2a/3a+1s分别结合在正义链和反义链环区,延伸后导致发夹结构打开,暴露出其他引物结合位点。关键中间结构可形成渐进式模型,驱动指数放大过程,如发夹(3a+1s+2s+3s+4s+5s)有两种功能,既可以与引物2a/4a和2a/3a在电路S1中催化生成3a+1s+2s+3s+4s和3a+1s+2s+3s,也可与引物2a/5a在电路S1和电路A1上都产生一个新的拷贝,从而起到递进放大的效果。作者也评估了这个渐进模型的敏感性,如图5B所示,随着目标浓度的增加,反应速度加快。图5C也证实,含有反义引物5a+4a和4a的系统比只使用引物3a的系统快,这是因为随着反义引物序列的引入,不同的扩增通路可被激活,有更多的机会形成更有功能的发夹,使反应动力学呈指数级变化。

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图5 具有指数动力学的递进模型。

A 反应原理图。多个中间体形成(3a+1s+2s +3s, 3a+1s+2s+3s+4s, 3a+1s+2s+3s+ 5s)。

B 10倍连续稀释靶标的递进模型实时放大曲线:400 M结核细胞(红方);40M结核细胞(蓝圈);4M结核细胞(黄色三角形);阴性对照(黑色三角形)。

C 实时检测引入不同反义引物体系的动力学:3a + 4a + 5a(蓝点);3a + 4a(红线);3a(黑色破折号)。阈值时间(Tt)为产生最大荧光强度20%的时间。

D 琼脂糖凝胶电泳显示不同数量的反义引物对反应的影响。lane1/2:3a + 4a + 5a;lane3/4:3a + 4a;lane5/6:3a。lane1/3/5用40M肺结核细胞;lane2/4/6是阴性对照。

作者最后验证了两种全新设计模型的适用性(图3a、5a),研究了其在实际医学诊断中的应用效果。将54个来自乙肝病毒患者的临床样本(如表1所示)用构建的方法检测,与金标准实时PCR比较,符合率高达96.3%。
表1

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总结
作者设计了基于中间抽象反应图案的通用策略,使有效且快速的端到端序列设计可以自动化。代码和方法是基于一种开放的创新模式提出的,只用输入特定的目标序列信息就可以编译发夹介导等温扩增中引物设计的功能图案。用一个通用的原则来克服目前需要不同分子设计才能克服的挑战。
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作者简介

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Jonathan M. Cooper,格拉斯哥大学生物工程学教授和前副校长,获得ERC高级研究员奖。专注于在生命科学界面中使用微技术和纳米技术(特别是在高级诊断和芯片实验室领域)的研究。在Nature Communication、JACS、ACS nano等高水平杂志发表多篇成果。

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Julien Reboud,格拉斯哥大学生物医学工程研究员,主要研究方向为微流体、声学、诊断。在Angewandte Chemie International Edition、lab on a chip、nano letters等高水平杂志发表多篇成果。

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樊春海,上海交通大学化学化工学院客座教授,国家转化医学中心执行主任,中国科学院院士(CAS院士),美国科学促进会(AAAS)、英国皇家化学学会(FRSC)、美国医学与生物工程学会(AIMBE)和国际电化学学会(ISE)的会员。ACS应用材料杂志副主编、ChemPlusChem编辑委员会联合主席。主要研究方向为双传感器、DNA纳米技术、生物光子,在同行评审期刊上发表论文500余篇。

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本文链接

DOI: 10.1038/s41467-022-29628-3


投稿:韩小乐

编辑:吴优

审核:杨宇君



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这个人很懒,什么都没留下

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